Detection of Fungal Gene of Candida spp. from Throat Swab of Tuberculosis Patient with Polymerase Chain Reaction Method

Abstract

Pulmonary tuberculosis is the leading cause of death associated with the Mycobacterium tuberculosis complex globally. The incidence of tuberculosis is calculated as dividing the number of new cases of the disease in a year in one hundred thousand population. Many risk factors associated with TB are coinfection with the fungus Candida spp. Coexistence between fungal pathogens and pulmonary TB is a common clinical condition in immunosuppressed patients. Thus, there is a need for screening in patients with tuberculosis co-infected with Candida spp, especially in cases of patients with inadequate response to OAT therapy. The purpose of this study was to determine the candida spp gene in throat swabs of TB patients at the Kalumata Health Center. The method used is descriptive analytic with a cross sectional design. The genes used were C. albicans (665 bp), C. Parasilopsis I (837 bp), C. Parasilopsis II (310 bp), C. guilliermondii (205 bp) and C. lusitaniae (799 bp). The results showed that from 30 samples found 7 sampels (23,3%) Candida albicans species, Candida parasilopsis II as many as 8 samples (26.7%) and 15 samples were negative (50%). The conclusion of this study is that from 30 samples, 15 samples were detected that had the Candida spp gene.

PENDAHULUAN

Penyakit infeksi (infectious disease) yang juga dikenal sebagai communicable disease atau transmissible disease merupakan suatu penyakit yang secara klinik terjadi akibat dari keberadaan dan pertumbuhan agen biologik patogenik pada organisme host individu. Penularan patogen dapat terjadi melalui berbagai cara yang meliputi kontak fisik, makanan yang terkontaminasi, cairan tubuh, benda, inhalasi yang ada di udara atau melalui organisme vector ([1]).

Tuberkulosis (TBC) merupakan penyakit menular dan merupakan ancaman serius bagi manusia. Organisasi Kesehatan Dunia pada tahun 2016 menyebutkan ada 9,6 juta orang terdeteksi kasus baru tuberkulosis dan 1,5 juta mengalami kematian ([2]). Secara global, tuberkulosis paru merupakan penyebab utama kematian yang disebabkan oleh Mycobacterium tuberkulosis, tuberkulosis (TBC) merupakan salah satu dari 10 penyebab kematian teratas di seluruh dunia. Lebih dari 95% penderita penyakit paru-paru dengan penyebab tuberkulosis telah dilaporkan dari negara berkembang, terutama dari Asia, Afrika, Timur Tengah dan Amerika Latin ([3]). Banyak faktor risiko seperti riwayat keluarga dari kontak dekat dengan pasien TBC, status sosial, usia, kemiskinan, jenis kelamin laki-laki, infeksi HIV, merokok, asma dan tunawisma memiliki peran penting dalam risiko pengembangan TBC ([3]).

Spesies jamur Candida merupakan jamur penyebab kandidiasis pada manusia yang terjadi di seluruh dunia dan menyerang segala usia, baik laki-laki maupun Wanita ([4]). Kandidiasis oral merupakan manifestasi klinis awal dan dialami oleh pasien TBC. Kandidiasis oral dapat meningkatkan morbiditas pada pasien koinfeksi TBC. Hal tersebut disebabkan timbulnya keluhan yang signifikan, antara lain ketidaknyamanan dalam rongga mulut, rasa nyeri, tidak dapat mengecap makanan, bahkan kesulitan menelan yang menyebabkan berat badan pasien terganggu akibat tidak cukup asupan makanan dan kualitas hidup pasien semakin menurun ([5]).

Gejala umum infeksi jamur pada paru sama dengan infeksi mikroba lainnya, antara lain batuk-batuk, batuk darah, banyak dahak, sesak, demam, nyeri dada dan bisa juga tanpa gejala. Pada penderita TBC paru dengan defek anatomi paru disertai pemberian obat anti tuberkulosa dalam waktu lama akan menekan flora normal sehingga pertumbuhan jamur oportunistik tidak terhambat. Infeksi jamur paru sering menyertai penyakit lain dan tidak ada gejala yang khas sehingga infeksi jamur sering tidak terdiagnosa dan keberadaan jamur dalam paru pun tidak diketahui, untuk itu pemeriksaan laboratorium sangat penting dengan mengidentifikasi adanya jamur pada sampel ([6]).

Perlunya skrining paru pasien tuberkulosis untuk koinfeksi Candida, terutama dalam kasus pasien dengan respons yang tidak adekuat terhadap terapi antituberkular. Tes sensitivitas antijamur sangat diupayakan dalam kasus spesies Candida non-Albicans. Berdasarkan hal tersebut maka penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi gen Candida spp. pada swab tenggorok pendertita TBC.

METODE

Jenis Penelitian

Jenis penelitian yang digunakan adalah analitik dengan desain cross-sectional.

Tempat dan Waktu

Pengambilan sampel dilakukan di Wilayah Kerja Puskesmas Kalumata sedangkan untuk identifikasi dengan menggunakan PCR dilaksanakan di Lab. NECHRI UNHAS. Peneliti telah mendapatkan persetujuan etik dengan nomor LB.02.04/2.3/181/2021 dari Poltekkes Kemenkes Ternate.

Populasi dan Sampel

Populasi penelitian adalah semua penderita penyakit tuberkulosis di Puskesmas Kalumata, Kota Ternate. Sampel pada Penelitian ini berjumlah 30 orang.

Bahan dan Alat

1. Seperangkat alat PCR dan alat elektroforesis gel. Swab Tenggorok
2. Primer PCR Candida albicans 665bp (Forward CABF 59 : TTGAACATCTCCAGTTTCAAAGGT Reverse CADBR 125:AGCTAAATTCATAGCAGAAAGC)
3. Primer C. parasilopsis 1 837bp (Forward CPPIF41:TGACAATATGACAAAGGTTGGTA Reverse CPPIR122 : TGTCAAGATCAACGTACATTTAGT)
4. C. parasilopsis II 310bp (Forward CPPIIF41 : GGACAACATGACAAAAGTCGGCA Reverse CPPIIR69 : TTGTGGTGTAATTCTTGGGAG)
5. C. Guiellermondii 205bp (Forward CGLF41 : CCCAAAATCACAAAGCTCAAGT Reverse CGLR61 : TACGACTTGAAGTTGCGAATTG)
6. C. lusitaniae 799bp (Forward CLTF39 : CATGTCGAAATGCAACCCCCCG Reverse CLTR119 : GCGTACACTTGTGGCCATCTTTA)
7. Malt ekstrak Agar
8. Alkohol, Larutan NaCl, natrium asetat, fenol, etanol 70%, bufer TE, aquades, bufer TBE, zat warna etidium bromide, trifosfat deoxynucleoside (dATP, dCTP, dTTP), Taq Polymerase, DNA templat 50ng sebanyak 5 mikro, bufer Tris-Borat EDTA, TBE, Bromphenol blue, Kappa master mix 2gfast, nuclease free water

Prosedur Kerja

Ekstraksi DNA

Ekstraksi DNA dilakukan sesuai dengan petunjuk teknis yang terdapat pada kit ekstraksi DNA merk Geneaid.

Multipleks PCR

Primer yang digunakan yaitu C. albicans (665 bp), C. parasilopsis 1 (887 bp), C. parasilopsis 2 (230 bp), C. guilliermondii (205 bp), C. lusitaniae ( 799 bp ). Campuran reaksi amplifikasi PCR diambil sebanyak 25 ?l dengan enzim Kappa sebanyak 12,5 ?l, MgCl. 0,5 ?l, 10 ?M primer forward 1 ?l, 10 ?M primer reverse 1 ?l dan produk DNA 10 ?l. Kemudian dilakukan amplifikasi pada alat PCR dengan suhu sebagai berikut:

1. Cycle 1 sebanyak 1x Suhu 95?C selama 2 Menit (Predenaturation)
2. Cycle 2 sebanyak x 25 Siklus
   • Step 1 Suhu 95?C selama 30 detik (Predenaturation process)
   • Step 2 Suhu 55?C selama 60 detik (Annealing process)
   • Step 3 Suhu 72?C selama 1 menit (Extension process)
   • Cycle 3 sebanyak 1x suhu 72?C selama 10 menit (Final extension process)
3. Set 3 dan 4
   • Cycle 1 sebanyak 1x Suhu 95?C selama 5 Menit (Predenaturation process)
   • Cycle 2 sebanyak x 35 Siklus
     • Step 1 Suhu 95?C selama 30 detik (Denaturation process)
     • Step 2 Suhu 57?C selama 30 detik (Annealing process)
     • Step 3 Suhu 72?C selama 1 menit (Extension process)
     • Cycle 3 sebanyak 1x suhu 72?C selama 2 menit (Final extension process)

Elektroforesis Gel Agarosa

Untuk mengetahui hasil amplifikasi DNA dilakukan proses elektroforesis terhadap produk PCR pada gel agarosa 2% dan perangkat elektroforesis dijalankan dengan mengalirkan aliran listrik 100 Volt 400 mA selama 90 menit.

Pengolahan dan Analisis Data

Pengolahan dan analisis data hasil PCR di buatkan tabel dan di persentasekan masing-masing spesies jamur Candida spp.

HASIL

Hasil penelitian meliputi karakteristik responden dan hasil gen Candida spp. Hasil penelitian didapatkan sebanyak 30 sampel swab tenggorok pada penderita Tb yang diambil di wilayah Puskesmas Kalumata.

Tabel 1. Karakteristik responden berdasarkan jenis kelamin DOI: https://doi.org/10.36990/hijp.v14i1.459.g487

Responden secara keseluruhan sebanyak 30 orang. Jika diklasifikasikan sesuai jenis kelamin, responden perempuan sebanyak 13 orang (43,3%) dan laki-laki sebanyak 17 orang (56,7%).

Tabel 2. Klasifikasi Candida berdasarkan hasil PCR DOI: https://doi.org/10.36990/hijp.v14i1.459.g488

Spesies yang ditemukan pada hasil multipleks PCR adalah Candida albicans pada 7 sampel (23,3%), Candida parasilopsis II pada 8 sampel (26,7%) dan negatif 15 sampel (50%).

Gambar 1. Amplifikasi pada PCR Sampel no. 1, 5, 10, 12, 13, 15 dan 19, 665 bp adalah C. albicans; sampel no. 3, 7, 8, 11, 21, 23, 26, dan 27, 310 bp adalah C. parasilopsis II DOI: https://doi.org/10.36990/hijp.v14i1.459.g489

PEMBAHASAN

TBC merupakan penyakit menular, dan masih merupakan ancaman serius bagi manusia. Menurut Organisasi Kesehatan Dunia, 9,6 juta orang (kisaran: 9,1-10 juta) terdeteksi kasus baru tuberkulosis, dan 1,5 juta kematian (kisaran: 1,1-1,7 juta) terkait dengan penyakit ini pada tahun 2014 ([2])

Metode yang digunakan untuk menganalisis DNA dari sel Candida secara molekuler menggunakan polymerase chain reaction (PCR) yaitu suatu metode enzimatis untuk amplifikasi DNA dengan cara in vitro. Pada proses PCR diperlukan beberapa komponen utama yaitu sampel, DNA cetakan, enzim DNA polimerase, oligonukleotida primer, (dNTP) deoksiribonukelotida trifosfat, dan komponen pendukung lain adalah senyawa bufer ([7]).

Pada Figure 1 menunjukkan bahwa laki-laki lebih banyak menderita TBC dibandingkan perempuan. Hal ini sejalan dengan penelitian Jaya & Mediarti ([8]) dengan hasil penderita TBC lebih banyak diderita oleh laki-laki. Alasan pasti mengenai lebih seringnya laki-laki diduga TBC dibanding wanita belum diketahui, namun hal ini diduga terkait dengan hormon Estradiol pada wanita yang berfungsi meningkatkan respons imunitas selular melalui aktivasi makrofag oleh IFN-gamma yang menyebabkan wanita memiliki ketahanan lebih dalam melawan tuberkulosis dibandingkan laki-laki.

Hasil identifikasi dengan menggunakan metode multipleks PCR, dimana menggunakan 5 pasang primer yaitu Candida albicans (665 bp), Candida parasilopsis 1 (837 bp), Candida parasilopsis II (310 bp), Candida guilliermondii (205 bp) dan Candida lusitaniae (799 bp) didapatkan identifikasi terbanyak yaitu Candida parasilopsis II (Figure 2 & Figure 3). Hasil yang berbeda dari penelitian Bhutia & Adhikari ([9]) di Rumah Sakit Pusat Rujukan di Sikkim, India. Bhutia & Adhikari melakukan pemeriksaan pada 200 sampel sputum dari pasien terduga TBC dengan pemeriksaan dilakukan dengan pemeriksaan mikroskopis langsung dengan KOH, pewarnaan gram dan kultur, dan didapatkan bahwa jamur yang paling banyak ditemukan dari pemeriksaan sputum adalah Candida sp. dan Aspergillus sp. Perbedaan penelitian ini dengan Bhutia & Adhikari ([9]) yaitu kami melakukan identifikasi hingga pada tahap genotipenya sementara penelitian lain hanya pada tahap fenotipenya saja.

Dalam penelitian ini, dari 30 sampel swab tenggorok hanya terdapat 15 sampel yang positif dengan menggunakan 5 pasang primer ini sehingga kemungkinan hasil yang negatif bukan berarti betul negatif karena masih ada 9 jenis Candida spp. yang tidak terdeteksi dengan menggunakan primer ini (Figure 2).

KESIMPULAN DAN SARAN

Ditemukan spesies Candida albicans pada 7 sampel, Candida parasilopsis II pada 8 sampel. Saran untuk peneliti selanjutnya menggunakan primer yang berbeda dan jumlah sampel yang lebih banyak.

Kekurangan Penelitian

Primer yang digunakan hanya 5 primer sehingga masih ada 9 jenis Candida spp. yang tidak terdeteksi dengan menggunakan primer ini.